西多福韦的作用机制核心是通过干扰病毒DNA合成，抑制病毒复制，最终达到抗病毒效果，其具体过程可分为三个关键步骤，且能精准靶向病毒、减少对人体正常细胞的影响：

进入细胞与激活转化：西多福韦作为一种“前体药物”，本身无直接抗病毒活性，需进入被病毒感染的细胞后，在细胞内酶的作用下逐步磷酸化，最终转化为西多福韦二磷酸酯——这是其发挥作用的活性形式。这个激活过程在病毒感染细胞内更易发生，保证了作用的靶向性。

竞争性结合病毒DNA聚合酶：病毒复制的关键步骤是借助自身的“DNA聚合酶”，将脱氧核苷酸原料连接起来，合成新的病毒DNA。而激活后的西多福韦二磷酸酯，结构与病毒DNA合成所需的天然脱氧核苷酸高度相似，会作为“假底物”，竞争性地结合到病毒DNA聚合酶上。

终止病毒DNA链延长：当西多福韦二磷酸酯被纳入正在合成的病毒DNA链中时，由于其分子结构缺少正常脱氧核苷酸的“延伸位点”，后续的脱氧核苷酸无法继续连接，导致病毒DNA链的合成被迫终止。没有完整的病毒DNA，病毒就无法完成复制、组装和传播，从而被抑制。

此外，西多福韦对病毒DNA聚合酶的亲和力远高于人体细胞的DNA聚合酶，因此主要针对病毒发挥作用，对人体正常细胞的损伤相对较小（但仍可能存在肾毒性等不良反应，需规范使用）。这种“模拟底物、终止链合成”的机制，使其对疱疹病毒、乳头瘤病毒等依赖DNA复制的病毒均具有抑制效果。